生物样品中痕量元素的测定

第一节概述

        人体的正常发育和健康与体内的微量元素的含量及其正常代谢有着密切的关系。微量元素在生物体内的生物学作用多种多样，取决于元素本身的理化性质、存在的形态及其在机体作用部位的浓度。如在各种酶中起催化作用、形成具有特殊功能的金属蛋白，以激素或维生素的必需成分或辅助因子发挥作用等。测定生物组织、体液、不同器官中的有关徽量元素的含量、存在形式和分布，不仅可为疾病的正确诊断和监测、病理研究提供重要信息，而且也为通过食物、营养保健、医疗等适时控制和调节体内有关微量元素的含量、预防疾病提供重要的依据。因此，生物样品中痕量元素的测定在生命科学中有着重要的意义。

        生物祥品中某些无机元素含量很低，为μg/g级甚至更低，在生命科学和医学中，将其称为微量元素。而在分析化学中，将试样中含量≤μg/g的元素称为痕量元素。就实际的生物样品分析面言，因受到各种因素的限制，取样量很少，为毫克和毫升级，或者更少，为10^-1mg和微升级，属微量分析范围，故生物样品中微量元素分析多数情况是在微量样品中检测痕量元素，实属微样痕量分析。在过去的文献中，有些作者使用“微量元素“一词，另一些作者又使用“痕量元素”一词，在两词使用上区别常常并不严格。在本书中，约定俗成，在论及元素的生物化学效应和功能时，遵从生物化学家的习惯用法，使用*微量元素'一词；当讨论生物样品中元素测定时，遵从分析化学家的习惯用法，使用'痕量元素'一词。

        在本章中所论及的生物样品中痕量元素测定，包括生命微量元素中的副族或过渡元素钒、铬、锰、铁、钻、镍、钢、锌和钼，主族元素硅、锡、硒、氟和碘，潜在的有益元素锂、铝、锗、砷和稀土等，以及与生物有密切关系的常见有害环境元素镉、汞、铅、钍和氨等放射性元素。生物样品中痕量元素测定，所检测的绝对量非常小，因此在选择测定方法时，方法的检出限和灵敏度显得非常重要。此外，也象通常的痕量元素测定那样，还要考虑测定方法的准确度、持效性或选择性、抗干扰能力，最好具有多元素同时检测的能力。目前已经开发出许多痕量元素的测定方法，电感耦合等离子体原子发射光谱、电感耦合等离子体质谱、各种激发源所产生的X荧光光谱如激光诱导原子荧光光谱、X射线激发荧光光谱、质子激发荧光光谱、中子活化分析等均具有很好的检出限和多元素同时检测的能力。石墨炉原子吸收光谱具有很高的绝对灵敏度，是测定痕量元素最有效的方法之一、高灵敏的分光光度法、催化动力学光度法、分子发光法等光学分析法，催化极谱法、阳极溶出伏安法等电化学方法也都广泛用于痕量元素的测定，其中一些方法具有多元素同时检测的能力。离子色谱、高效毛细管电泳是高灵敏检测阴离子的技术。色谱、流动注射和不同检测方法相结合的各种联用技术正在迅速发展之中，它们将为形态分析提供有效的手段。原位检测技术(如各种微探针和生物传感技术)可以对体内微量元素进行原位监测、直接获得微量元素在体内生物活性的信息，目前这方面的文献资料非常少，但却是很有发展前途的一个领域。从原则上讲，有效用于其它试样中痕量元素测定的方法，亦可移用于生物样品。当然，在“移植”这些测定方法时，不能`生搬硬套'，而要根据生物样品的特点适当地加以改变。随着科学技术的发展，各种新技术引入分析测试领域，还将不断地开发出更多、更好的测定生物样品中痕量元素的方法。

第二节生物样品中痕量元素测定的要求和困难

生物样品中和其它祥品中的痕量元素测定有其相同之处，亦有其自身的特点。概括地说，生物样品中的痕量元素测定的要求与困难主要有如下几点：

(1)要求样品有良好的代表性。对于任何生物样品分析，首要的问题是要获得有充分或足够代表性的试样。由于微量元素在生物体内分布的不均匀性，且处于动态平衡过程中，微量元素的含量及其分布会随环境条件而有所变化。如某些微量元素在脑组织各部位的含量不同；人发中微量元素由于新陈代谢，在不同时间含量亦会有差别，也因各人的健康状况而产生变化。特别是从活体采样，使机体产生应激反应，甚至在采样部位出现炎症反应，导致产生许多生化反应，如生物大分子的合成和降解，异常生物分子的出现等，使微量元素在体内的分布发生改变，如白细胞在炎症时数目增加，使体内Zn在各组织中重新分配。在这种情况下，不可能取得具有充分或足够代表性的试样，因此，对样品的代表性要予以特别的重视。否则，所测得的结果不会有什么实用价值。

(2)保持微量元素的原有形态和活性。在通常的条件下，采集到的生物样品有时会或多或少地受到玷污，必需采取适当的方法除去外源玷污。在分析生物样品时，除了分析象血液、唾液、精液等这类样品，可以用合适溶剂简单稀释后直接进行测定外，测定之前通常都要采用湿法消化、干法灰化、低温灰化或酶消化法对样品进行消化以去除基体，并将被测元素转化为可测定的形式。在去除外源玷污、去除基体和富集被测元素的过程中，保证不使样品受到新的污染和造成被测元素的丢失，有时还需要保持微量元素原有形态和活性，这是一个很重要、又是一个相当棘手的高难问题，而要做到这一点是很不容易的。

(3)要求测定方法具有低的检出限和很高的灵敏度。生物样品中微量元素分析多数属微样痕量分析，测定方法必须具有低的检出限和高的灵敏度，否则，不可能检出或者获得准确可靠的定量结果。

(4)不仅要测定痕量元素的总量，而且要分析元素的形态。有些微量元素的生物化学效应和作用机制直接依赖于其在体内存在的形态，只测定痕量元素总量常常难以说明问题的本质。为了准确地了解和深入研究微量元素在生物体内的作用机制，测出样品中各种痕量元素的形态分布是非常必要的。各种联用分析技术、非破坏性分析，特别是活体原位分析与连续监测方法，对于确定生物中微量元素存在的化学形态及其在体内的作用机制，将是十分有效的手段。然而目前这类分析方法非常少，很值得分析工作者今后大力去研究和开发。

(5)要求数据有可比性。由于缺乏生物标样，没有采用公认的标准分析方法和必要的质量控制，现有的不少文献资料往往缺乏可比性。如果测定结果没有可比性，不同试验室与不同人的测定结果之间彼此差别较大，就不可能或难以从中得出科学的结论。因此，在分析生物样品时，应尽量使用标准方法和标祥进行全程质量控制，以保证测定结果的准确可靠与可比性。

第三节生物测定样品的制备

        前面已经指出，在分析生物样品时，除了少数样品如血液、唾液、尿液、精液等，有时可以用合适溶剂，如Tri-ton X-100（异辛基苯氧基聚乙氧基乙醇）、正丁醇、丙醇、酸等简单稀释后直接进行测定。测定某些微量元素，甚至可用酸溶液简单地浸取被测元素，如用三氯乙酸从血清蛋白中浸取铁，用2mol/LHCI在60℃从血浆中浸取锰等。在多数情况下，测定之前通常都需要对样品进行预处理。样品预处理是整个分析过程的关键环节，对生物样品预处理的基本要求是防止样品受到新的污染、被测组分的丢失、化学形态的改变，在有些情况下，还要求保持原有的生物活性。典型的预处理操作是对样品进行消化，常用的方法有湿法消化、干法灰化、低温灰化、酶消化法等，这些方法各有特点。有关各种生物样品的预处理方法的全面论述，请参阅第二章。这里只就常见的几种类型的生物样品，如毛发、血液、尿、软组织及组织液、骨和牙齿等的测定样品制备方法作一简述。至于针对某一具体分析样品的某一特定痕量元素测定的详细处理操作，将在以后几章介绍各元素测定方法时分别予以说明。

一、毛发样品制备

分析发样时，采集颈部距发根1cm以上的全发1~5g，将人发剪至长度约2~3mm左右，用3%~5%的中性洗涤剂溶液在不断搅拌下浸泡0.5~1h，或在5%的氨水中于室温浸泡1h，洗去人发上的外源性污染物和油脂物，再依次用自来水和去离子水清洗多次，除尽洗涤剂或氨水，自然晾干或在烘箱内于80~100℃烘干。毛发样品的消化方法有：

(1)湿法消化样品。在样品中加入混酸HCIO₄+HNO₃、H₂SO₄+HCIO₄、HNO₃+HCIO₄+H₂O₂后.放置浸泡两小时，再在电热器上加热溶样，直至溶液变清亮为止。继续加热冒白烟，除去多余的HCIO₄有时加入铝酸铵作催化剂加速溶样。再用适当浓度HCI、HNO₃或其它合适的溶剂溶解消化后的残渣。

(2)干法消化样品。将样品在马福炉中于200~250℃炭化2~3h，再在500~600℃灰化发样4~7h。用少量适当浓度HCI或HNO₃溶解消化后留下的残渣，以合适的酸溶液将发样消化液定溶到一定体积。

(3)用25%氢氧化四甲胺(TMAH)或其乙醇溶液溶解发样。